BD_FACSCalibur流式細胞儀是一種強大的單細胞分析技術，廣泛應用于免疫學、腫瘤學、血液學、干細胞研究和藥物開發(fā)等領域。它能夠快速、高效地對細胞或微粒進行多參數(shù)檢測，并提供定量和定性分析。
工作原理
BD_FACSCalibur流式細胞儀的核心原理是利用激光束照射單個細胞，并通過檢測散射光和熒光信號來分析細胞的物理和生化特性。其基本工作流程如下：
1.樣本制備：待測細胞或微粒被熒光標記（如抗體偶聯(lián)熒光染料）后制成單細胞懸液。
2.流體聚焦：樣本通過鞘液包裹，形成單細胞流，確保細胞逐個通過檢測區(qū)。
3.激光激發(fā)：細胞流經(jīng)激光束時，熒光染料被激發(fā)并發(fā)射特定波長的光。
4.信號檢測：
-前向散射光（FSC）：反映細胞大小。
-側向散射光（SSC）：反映細胞內(nèi)部復雜度（如顆粒度）。
-熒光信號：反映特定分子（如表面標志物、胞內(nèi)蛋白）的表達水平。
5.數(shù)據(jù)分析：計算機系統(tǒng)收集信號，通過軟件（如FlowJo、FCSExpress）進行統(tǒng)計和可視化分析。
在細胞表型分析中的應用
細胞表型分析是流式細胞儀經(jīng)典的應用之一，主要用于鑒定和分類不同細胞亞群。例如：
1.免疫細胞分型
在免疫學研究中，流式細胞儀可區(qū)分T細胞（CD3+）、B細胞（CD19+）、NK細胞（CD56+）等，并進一步細分亞群（如CD4+輔助T細胞和CD8+細胞毒性T細胞）。通過多色熒光標記（如10色以上流式），可以同時分析多種表面標志物，揭示免疫系統(tǒng)的精細調(diào)控機制。
2.腫瘤細胞鑒定
在白血病和淋巴瘤診斷中，流式細胞儀通過檢測腫瘤特異性抗原（如CD34、CD19、CD5）輔助分型。例如，急性髓系白血?。ˋML）細胞可能高表達CD33和CD117，而慢性淋巴細胞白血?。–LL）細胞則常表達CD5和CD23。
3.干細胞研究
流式細胞儀可用于分離和鑒定干細胞（如CD34+造血干細胞），并監(jiān)測其分化狀態(tài)。結合轉錄因子（如OCT4、SOX2）的胞內(nèi)染色，可評估干細胞的“干性”維持情況。
在細胞功能分析中的應用
除了表型分析，流式細胞儀還能動態(tài)監(jiān)測細胞功能，包括：
1.細胞周期與增殖
通過DNA染料（如PI、DAPI）染色，流式細胞儀可分析細胞周期分布（G0/G1、S、G2/M期）。此外，增殖染料（如CFSE）可追蹤細胞分裂次數(shù)。
2.細胞凋亡與死亡
AnnexinV-FITC/PI雙染可區(qū)分早期凋亡（AnnexinV+PI−）和晚期凋亡/壞死（AnnexinV+PI+）。Caspase活性檢測則進一步揭示凋亡通路激活情況。
3.細胞內(nèi)細胞因子與信號通路
通過破膜固定技術，可檢測胞內(nèi)因子（如IFN-γ、IL-2）或磷酸化蛋白（如p-STAT3），評估免疫細胞的功能狀態(tài)。例如，Th1/Th2細胞因子的平衡分析有助于理解自身免疫疾病機制。
4.鈣流與活性氧（ROS）檢測
熒光探針（如Fluo-3、DCFH-DA）可實時監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子濃度或氧化應激水平，用于藥理學或毒理學研究。
技術進展
近年來，BD_FACSCalibur流式細胞儀技術不斷革新，主要包括：
1.質(zhì)譜流式（CyTOF）：用金屬同位素替代熒光染料，突破傳統(tǒng)熒光通道限制，實現(xiàn)40+參數(shù)檢測。
2.光譜流式：通過全光譜解析，減少熒光串擾，提高多色實驗準確性。
3.成像流式：結合顯微鏡功能，在獲取熒光數(shù)據(jù)的同時記錄細胞形態(tài)。
4.微流控芯片：實現(xiàn)低成本、便攜式細胞分析，適用于床邊檢測（POCT）。
